Usare i nanopori per rilevare più velocemente i cambiamenti epigenetici

I cambiamenti noti come modificazioni epigenetiche svolgono un ruolo importante, tra l’altro, nello sviluppo del cancro. Essere in grado di analizzarle in modo rapido e affidabile potrebbe, ad esempio, contribuire in modo significativo all’ulteriore sviluppo di una terapia personalizzata. Un gruppo di ricerca dell’Istituto di fisiologia dell’Università di Friburgo è ora riuscito a caratterizzare i cambiamenti chimici nelle proteine, tipici delle modifiche epigenetiche, utilizzando l’analisi dei nanopori. I ricercatori hanno pubblicato i risultati della loro ricerca sul Journal of the American Chemical Society (JACS).

Negli ultimi anni, i nanopori sono diventati uno strumento ampiamente applicabile per l’analisi delle molecole. Grazie alle loro particolari proprietà, consentono di analizzare la struttura delle molecole in frazioni di secondo: come proteine disposte in modo cilindrico, i nanopori formano minuscoli canali del diametro di pochi milionesimi di millimetro (nanometri) che possono essere incorporati nelle biomembrane. “Per gli esperimenti, applichiamo una tensione costante sulla membrana in modo che gli ioni del mezzo circostante passino attraverso il poro. Questo crea una corrente elettrica costante e misurabile con precisione”, spiega il Prof. Dr. Jan C. Behrends della Facoltà di Medicina dell’Università di Friburgo, nel cui laboratorio si sono svolti gli esperimenti ora pubblicati. Tuttavia, quando una molecola migra nel poro, la corrente viene bloccata: più grande è la molecola, più forte è il blocco.

Una proteina sotto i riflettori della ricerca: H4

Nel contesto degli esperimenti ora pubblicati, gli scienziati di Friburgo si sono dedicati all’indagine della cosiddetta proteina istone H4. Questa proteina è saldamente associata al DNA in tutte le cellule con un nucleo ed è uno dei bersagli più studiati delle modifiche epigenetiche. Una regione all’estremità N-terminale della proteina è particolarmente interessata da queste modifiche. “La sequenza della proteina contiene più volte l’amminoacido lisina”, spiega Behrends. A queste lisine, denominate K8, K12 e K16 in base alla loro posizione nella catena proteica, possono essere attaccati gruppi acetilici o metilici, ad esempio, come parte delle modifiche epigenetiche. Quale modifica chimica avvenga in quale posizione della lisina è sicuramente di importanza medica, come sottolinea il fisiologo di Friburgo. “L’acetilazione in K16, per esempio, è importante per lo sviluppo umano, mentre la metilazione in K12 ha un ruolo nello sviluppo di alcuni tumori della prostata e del polmone, secondo gli ultimi risultati del Centro Medico – Università di Friburgo”.

Rilevare i cambiamenti con l’aiuto di un nanoporo

Nei loro esperimenti, Behrends e il suo team sono stati in grado di distinguere chiaramente i frammenti H4 con o senza acetilazione, nonché i frammenti con una, due o tre acetilazioni. Inoltre, sono riusciti a dimostrare che il nanoporo utilizzato era sensibile anche al sito di acetilazione: i frammenti di istone con un gruppo acetilico a K8 bloccavano la corrente attraverso il poro più fortemente di quelli acetilati a K12, e questi a loro volta più fortemente di quelli con un’acetilazione a K16. “Questo tipo di sensibilità è sorprendente perché questi frammenti sono identici in termini di massa e volume totale”, spiega Behrends. Pertanto, la corrente dei pori sembra essere sensibile non solo alle dimensioni, ma anche alla forma della molecola. È stato altrettanto facile distinguere tra le diverse varianti di frammenti di istone doppiamente acetilati – K8 e K12, K8 e K16 e K12 e K16 – ancora una volta, nonostante la massa identica. Anche i frammenti H4 metilati in misura e posizione diverse bloccano la corrente attraverso il poro in misura diversa, anche se non in modo così evidente come le varianti acetilate.

“Siamo riusciti a dimostrare per la prima volta, attraverso i nostri esperimenti, che l’analisi dei nanopori ci permette di distinguere le molecole non solo in base alle loro dimensioni, ma anche in base alla loro forma”, riassume il responsabile dello studio Behrends. Le simulazioni di dinamica molecolare condotte dal gruppo di ricerca guidato da Aleksei Aksimentiev dell’Università dell’Illinois negli Stati Uniti – anch’esso coinvolto nello studio – mostrano che un campo elettrico altamente disomogeneo all’interno del poro gioca un ruolo chiave per questo effetto.

Visione futura: diagnostica medica ottimizzata

Mentre il sequenziamento del DNA mediante nanopori è già affermato e commercializzato, lo sviluppo dell’analisi delle proteine basata sui nanopori è appena agli inizi, sottolinea Behrends. “La difficoltà nel sequenziamento delle proteine è che si tratta di molecole con schemi di carica non uniformi”. Mentre il DNA, che è carico negativamente, migra in modo direzionale nel campo elettrico e può quindi essere trascinato attraverso il poro base per base, le proteine sono costituite da blocchi di aminoacidi con cariche diverse. Di conseguenza, il movimento diretto nel campo elettrico e la “scansione” amminoacido per amminoacido non sono possibili. Gli scienziati di Friburgo si sono quindi affidati a un approccio diverso per i loro esperimenti. Invece di un poro con una breve costrizione, come si usa nel sequenziamento del DNA, hanno usato un poro fatto su misura con una specie di trappola molecolare. “Questo ha permesso di catturare l’intero frammento proteico in una sola volta”, spiega Behrends.

Non è ancora chiaro fino a quale dimensione di frammento questo tipo di analisi possa essere utilizzato. Tuttavia, ulteriori esperimenti dimostrano che il metodo sarà adatto anche all’analisi dei frammenti H4 precedentemente utilizzati nella ricerca epigenetica. Questi contengono 14 aminoacidi invece dei dieci utilizzati qui, e sono attualmente studiati per le modifiche epigenetiche con la spettrometria di massa tandem, una tecnica molto elaborata. I ricercatori sperano che i nanopori rendano l’analisi molto più semplice, veloce ed economica e che possa essere effettuata vicino al paziente.

L’ulteriore sviluppo dell’analisi nanopore delle proteine per la diagnostica medica e la sua implementazione in prodotti e servizi concreti è anche uno dei progetti centrali del Cluster4Future nanodiagBW, recentemente approvato dal BMBF, che Behrends dirige insieme al Prof. Dr. Felix von Stetten della Hahn-Schickard-Gesellschaft, che è il capofila di questo progetto.